1. 组合柱层析色谱法、HPLC分析
Li Rui[1]等 X-5树脂和Sephadex LH-20结合的方法从V. uliginosum berry里分离纯化得到11种花青素和两种多酚。具体操作方法：25 mL提取液过X-5树脂（乙醇，0.5%TFA处理），然后用0.5 % TFA (v/v)去离子水冲洗2次去除多糖，有机酸等水溶性杂质；接着多酚由乙酸乙酯洗脱回收，0.5% TFA (v/v)乙醇洗脱4次回收得到花青素。浓缩得到的花青素采用Sephadex LH-20色谱柱进一步纯化，采用含有 0.5% TFA的30%乙醇水溶液为洗脱溶剂。洗脱下来的片段采用分光光度法在525nm处检测。每部分洗脱液在35 oC真空下旋转蒸发（RE-52AA, Yarong, Shanghai, China) **干燥，然后再用0.5% TFA (v/v) 溶液溶解，分析前-20 o
C下保存。分析方法为HPLC–DAD-ESI-MS 和MS/MS
**二雷[2]等也分别采用组合层析和半制备型高效液相色谱的方法从野生蓝莓中分离得到高纯度的花青素混合物和单体。利用 UV-vis 和高效液相色谱对花青素含量进行检测，利用 HPLC 和 HPLC-DAD-ESI-MS/MS 对纯化样品中的花青素进行种类鉴定。
shou先，将野生蓝莓粗提液用乙酸乙酯萃取4次，将萃取之后的水相上
Amberlite XAD-7HP (20–60目， Sigma-Aldrich)阳离子交换柱（2.6 cm50 cm）。然后用2 L含0.01% HCl 的去离子水以1 mL/min的流速冲洗柱子，以去大部分的除多糖，有机酸，蛋白和离子。用1 L 35%的酸化乙醇溶液（0.01% HCl）做为洗脱液，流速为1.5 mL/min进行洗脱。根据柱中颜色边界层以及在520 nm处的UV-vis检测结果进行洗脱液的收集，再浓缩（不超过40 oC），冷冻干燥制得花青素粗提物。用300 mL 60–80% 乙醇溶液 (0.01% HCl)将弱极性的花青素和其他酚类进行完全洗脱，备用。
然后，取0.1 g 经上一步树脂纯化的色素粗提物用20 mL去离子水溶解，上Sephadex LH-20层析柱（1.0 cm × 60 cm; Sigma Chemical Co., St. Louis,MO, USA），用1 L 25% 乙醇溶液(0.01%HCl)以1.2 mL/min的流速洗脱，并用10 mL试管收集洗收集不同组分，分别浓缩、冷冻干燥制得蓝莓花青素纯化样品。
**后，为了得到花青素的单体，将LH-20分离得到的各部分样品经半制备型高效液相色谱进一步纯化，得到高纯度的花青素单体。
研究优点：此采用采用乙醇，乙酸乙酯，盐酸等无毒或低毒溶剂，取代了常规的剧毒有机溶剂比如甲醇，丙酮，三氟乙酸等。
同样的Giuliana Catalano[3]， Luis Cabrita[4]， Zhaoqi Zhang[5]等人也采用Amberlite XAD-7树脂和Sephadex LH-20柱层析的方法分别从毛野豌豆的花瓣、蓝莓和荔枝果皮中分离得到花青素；**峰[6]采用柱层析法对黑花生衣色素进行分离纯化，方法流程为：黑花生衣→50%甲醇(含0.1%三氟醋酸)浸提→浓缩→乙酸乙酯萃取→脱有机溶剂→XAD-7HP大孔树脂纯化→聚酰胺纯化→葡聚糖凝胶LH-20纯化→得到两种色素单体；Gary R. Takeoka[7]等从黑豆中用固相萃取（硅藻土）和制备型HPLC法分离得到了3种花青素。 2. 高速逆流色谱和柱层析结合法
Andreas[8]等人采用Amberlite XAD-7树脂和高速逆流层析（HSCCC）的方法从玫瑰茄，紫甘蓝，黑醋栗，黑果梨等中分离得到多种花青素，并对其抗氧化性能进行测试筛选。具体过程为：先用Amberlite XAD-7层析柱 (50 cm*4 cm, Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) 对花青素粗提液进行初步纯，洗脱液组成为甲醇/乙酸(19:1, v/v)。洗脱液在真空下浓缩，然后冷冻干燥保存。接着采用高速逆流色谱进一步纯化，高速逆流色谱设备配备3个串联的制备线圈（d=2.6 mm, V= 850 mL），转速为1000 rpm，所用的溶剂体系组成为叔丁基甲醚/正丁醇/乙腈/水（2:2:1:5），并用三氟乙酸酸化，流速为5 mL/min，之前冷冻干燥的花青素产品用1:1体系的轻相和重相溶解，由环式注射器进样。HPLC-DAD, TLC, ESI-MS/MS和1H NMR分析方法用来检测分离的花青素的纯度及分子式。
Koichi[9]等建立了一套高速逆流色谱分离方法实现了花青素的纯化分离。 两相溶剂系统的优选。
Bo Li[10]等采用高速逆流色谱和C18反向色谱连用的方法从黑米中分离得到纯度高达94.38% 的Cyanidin-3-O--d-glucoside花青素。 具体方法：
（1）LC–UV–MS/MS( LC/MSD trap----Liquid Chromatography/Mass Spectrometer Detector ion trap) 液相色谱/质谱联用仪离子阱方法鉴定花青素种类，设备：Agilent 1100 series（Palo Alto, CA, USA）配备ESI（electrospray ionization source）电喷射粒子化器和一个DAD(diode-array detector)二极管阵列检测器；所用分离柱材料为YMC ODS-AQ 柱 (3 m, 150 mm×4.6 mm i.d., Kyoto, Japan). 流动相A为甲酸/(8.5:91.5, v/v)，B相甲酸/甲醇/乙腈/水(8.5:22.5:22.5:41.5, v/v/v/v)。
（2）HPLC法对高速逆流色谱两相溶剂系统的优选。根据分配系数（K）所用两相溶剂系统的组成为：水-正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-三氟乙酸。**佳比例根据分配系数K和固定相的保留比例确定。
（3）经高速逆流分离得到的产品进一步用反向C18色谱进一步纯化，得到花青素单体。YMC PACK ODS-AQ C18 column (50 m, 50 cm×3 cm i.d.)， 洗脱剂为含0.1% TFA的22%甲醇，流速为2 mL/min。（4）**后再由核磁的碳普氢普确认所分离物质。
参考文献
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[3] Catalano, G., Fossen, T., and Andersenc, Ø.M., Petunidin 3-O-α-Rhamnopyranoside-5-O-β-glucopyranoside and other anthocyanins from flowers of vicia villosa, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46 (11), 4568–4570.
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