薄层层析是一种微量而快速的层析方法。**早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中**常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。对己分开 的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。
薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分shou先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的Rf值大于中央位置的Rf值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显色方法甚**可以用腐蚀性显色剂。
取硅胶G粉30g加75毫升0.1mol/L硼酸溶液，调匀后铺于洁净平整的玻板上，铺层后的薄板于100oC烘箱中烘干。取出后可用，亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。2． 糖在硅胶G薄层上的分离
选制备好的薄板一块，在距底边1.5cm的直线上选四个点，相互距离2cm。用毛细管分别点上不同的糖样品于四个点，样量控制在5-50µɡ，斑点直径不超过2mm。待薄层上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板项端约1cm处时取出薄板，前沿作一记号，60oC烘干2-3小时（或空气中晾干），除尽溶剂后均匀地喷上苯胺-二苯胺-磷酸显色剂，85oC烘10分钟，各种糖则分别显出不同的颜色。记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值。
糖的硅胶G薄层层析
一. 目的
糖类是自然界存在的数量**多的有机化合物,它既是植物躯体和细胞的结构成份,又是 生命活动能量的主要来源,并且与植物体内各类物质的代谢密切相关,分离鉴定植物组织中 可溶性糖的种类及其变化,对了解植物体内的组织代谢和农产品的品质,具有重要意义. 本实验采用硅胶G薄层层析法,分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类,要求通过本实验, 学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法,掌握吸附薄层层析的原理,操作及其在糖类鉴定 中的作用. 二. 原理
植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来,经除去杂质,即可获得较纯的可 溶性糖混合物.
薄层层析是层析法的一种,层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理,化学差别, 使各组分以不同程度分布在两个 相 中,这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的, 称为固定相;另一个是移动的,称为流动相;当流动相流过固定相时,在移动过程中由于各 组分在两相中的分配情况不同,或吸附性质不同,或电荷分布不同,或离子亲和力不同等, 而以不同速度前进,从而达到分离的目的.
薄层层析是一种快速而微量的层析方法,它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上,对 物质进行层析的方法,本实验只讨论吸附薄层层析,即所有支持物是吸附剂(如硅胶粉), 层析时,主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同,因此个组分的移动速度不同, 从而达到分离混合物的目的.
糖为多羟基化合物,具有较强的极性,在硅胶G薄板上展层时,糖与硅胶分子有一定的吸附力.硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目,不同的糖分子由于分 子量及羟基数的不同,因而它与硅胶分子间的吸附力不同.造成各种糖分子在展层过程中移 动的距离不同,从而将各种糖分离出来,一般吸附力的大小为:三糖>双糖>己糖>戊糖.其 中各种糖移动的速率可用Rf值表示.通过与标准糖的Rf值比较.即可鉴定出植物组织提取 液中糖的种类.
溶质斑点中心到样点的距离 Rf( 值) = 溶剂前沿到点样点的距离 三. 实验材料,仪器和试剂 1. 材料:苹果或其他植物材料 2. 仪器:
(1) 离心机及离心管 (2) 药物天平 (3) 研钵 (4) 量筒 25ml (5) 移液管 10ml (6) 恒温水浴 (7) 毛细管 (8) 层析缸 (9) 吹风机 #p#分页标题#e#
(10) 玻璃板 :7 15cm (11) 烘箱 (12) 喷雾器
(13) 烧杯 50ml,100ml 铅笔,尺子 3.试剂 (1) 无水酒精 (2) 氯仿 (3)冰醋酸
(4)1%标准糖溶液(10mg/ml):木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖等.
(5)苯胺-二苯胺-磷酸显色剂:2克二苯胺,加2ml苯胺,10ml 85%磷酸,1ml 浓HCl,100ml丙酮,溶后摇匀. (6)0.1M硼酸溶液 四. 操作步骤 1. 板的制备:
取硅胶G粉2克(或硅胶H粉1.7克+无水CaSO4 0.3克),加01M硼酸溶液4.5ml于 研钵中充分研磨成糊状时,倾倒在薄板上(玻璃板须表面平整,光滑,清洁.即光用洗 液或其他洗涤液浸泡,洗净,晾干,否则吸附剂容易剥落),可铺7 15厘米薄板两块 并马上用玻璃棒涂匀,然后用手轻轻倾斜玻璃板,使糊状吸附剂在整块板上分布均匀,表面平坦光滑,加硼酸搅拌及研磨的时间和铺板的速度是涂层铺板的关键之一,一般研 磨到吸附剂为硼酸液所饱和时粘度**大,发出如脂肪光泽时,立即涂匀为**好.将制好 的薄板置于水平台上自然晾干后,用前于110℃烘箱中活化一小时使用. 2. 水果中可溶性糖提取液的制备
取洗净的苹果(或其他水果)削去果皮,称3g果肉在研钵中研成匀浆后,倒在双层洗 净的纱布上.包起置于漏斗,用干净玻璃棒将果汁压出.取果汁1ml于离心管中,加无 水乙醇3ml,充分混匀后,在3000转/分下离心20分钟,上清夜即为可溶性糖提取液. 3. 苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定
取活化后的硅胶G板一块,距底边1.5厘米水平线上确定5个点,相互间隔1厘米,其 中4个点,分别点上5%的木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖标准溶液数滴,另一点点上苹果 提取液数滴.在用毛细管点样时,毛细管应垂直于硅胶G板的方向点样,而且毛细管接 触G板的时间应尽量短,不然点样斑点直径难以控制,以氯仿:冰醋酸:水=30:35: 5为展层剂上行展层,当展层前沿达距薄板顶端1厘米处,取出玻板用吹风机吹干,然 后以苯胺-二苯胺-磷酸显色剂喷雾,于85℃烘箱中10分钟,各种糖即显示出不同色 斑与标准糖比较,根据斑点颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的 种类. 五. 结果
显色后绘出层析板图谱或照相,并计算各点Rf值. 糖的硅胶G薄层层析分离与定性,定量鉴定 【目的和要求】
1.了解并初步掌握吸附层析的原理.
2.学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法. 【原理】
薄层层析是一种广泛应用于氨基酸,多肽,核苷酸,脂肪类,糖
脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法.由于层析是在吸附 剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的,所以称之为薄层层析. 薄层层析的主要原理是,根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在 展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离.当展层溶剂移动时, 会带着混合样品中的各组分一起移动,并不断发生吸附与解吸作用以 及反复分配作用.根据各组分在溶剂中溶解度不同和吸附剂对样品各 组分的吸附能力的差异,**终将混合物分离成一系列的斑点.如果把 标准样品在同一层析薄板上一起展开,便可通过在同一薄板上的已知 标准样品的Rf值和未知样品各组分的Rf值进行对照,就可初步鉴定 未知样品各组分的成分.
薄层层析根据所支持物的性质和分离机制的不同包括吸附层析, 离子交换层析和凝胶过滤等.糖的分离鉴定可用吸附剂或支持剂中添 加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上,可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上.
硅胶G是一种已添加了黏合剂 石膏(CaSO4)的硅胶粉,糖
在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关,经 适当的溶剂展开后,糖在硅胶G薄析上的移动距离为戊糖>已糖>双糖 >三糖.若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高高糖的 分离效果.如对已分开的斑点显色,而将与它位置相当的另一个未显 色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下,以适当的溶液将糖从硅胶G上 洗脱下来,就可用糖的定量测定方法测出样品中各组分的糖含量. 薄层层析的展层方式有上行,下行和近水平等.一般常采用上行 法,即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行,将适量的展层 溶液倒于缸底,把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示). 保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸气是实验成功的关键. 与纸层析,柱层析等方法比较,薄层层析有明显的优点:操作方 便,层析时间短,可分离各种化合物,样品用量少(0.1**几十向微 克的样品均可分离),比纸层析灵敏度高10～100倍,显色和观察结 果方便,如薄层由无机物制成,可用浓硫酸,浓盐酸等腐蚀性显色剂. 因此,薄层层析是一项实验常用的分离技术,其应用范围主要在生物 化学,医药卫生,化学工业,家业生产,食品和毒理分析等*域,对 于天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用. 【操作方法】
1.硅胶G薄层板的制备
将制备薄层用的玻璃板预先用洗液洗干净并烘干,玻璃板要求表 面光滑.
称取硅胶G粉6g,加入12mL 0.1mol/L硼酸溶液,用玻棒在烧 杯中慢慢搅拌**硅胶浆液分散均匀,黏稠度适中,然后倾倒在干净, 干燥的坡璃板上,倾斜玻璃或用玻棒将硅胶G由一端向另一端推动, 使硅胶G铺成厚薄均匀的薄层.待薄板表面水分开干燥后置于烘箱 内,待温度升**110℃后活化30min.冷却**室温后取出,置于干燥 器中备用(注意:避免薄板骤热,骤冷使薄层断裂或在展层过程中脱 落).制成的薄层板,要求表面平整,厚薄均匀. 手工涂布薄板的方法: #p#分页标题#e#
(1)玻棒涂布:选用一根直径为1～1.2cm的玻璃棒或玻璃管在 两端绕几圈胶布,胶布的圈数视薄层的厚度而定,常用厚度为0.56～ 1.0mm,把吸附剂倒在玻璃板上,用这根玻璃棒在玻璃上将吸附剂向 一个方向推动,即成薄板.
(2)倾斜涂布:将吸附剂浆液倒在玻璃上,然后倾斜使吸附剂 漫布于玻板上面成薄层. 2.点样
取制备好的薄板一块,在距底边1.5cm处划一条直线,在直线上 每隔1.5～2㎝作为一记号(用铅笔轻点一下,不可将薄层刺破),共 4个点.用0.5mm直径的毛细管吸取取糖样品量约5～50 g,点样体 积约1-1.5 L,可分次滴加,控制点样斑点直径不超过2mm.在点 样过程中可用吹风机冷热风交替吹干样品,也可以让样自然干燥. 3.展层
将已点样的薄板点样一端放入盛有展层溶剂的层析缸中,展层液 面不得超过点样线,层析缸密闭,自下向上展层,当展层溶剂到达距 薄析顶端约1cm处时取出薄板,前沿用铅笔或小针作一记号.60℃烘 箱内烘干或晾干.
4.将苯胺-二苯胺磷酸显色剂均匀喷雾在薄层上,置85℃烘箱内 加热**层析斑点显现(如图2所示),此显色剂可使各种糖显现出不 同的颜色,如表1所示. 表1
糖的种类 木糖 葡萄糖 蔗糖 显色 黄绿 灰蓝色绿 蓝褐 5.样品中糖定性鉴定
薄层显色后,根据各显色斑点的颜色相对位置,测算Rf值 将混合样品图谱与标准样品图谱相比较或通过混合样品与标准 样品Rf值的比较,确定混合样品中所分离的各个斑点分别为何种糖. 6.定量测定
【影响Rf值的因素如下】
①展层溶剂的样品组分的性质:样品组分若在固定相中溶解度较 大,在流动相中溶解度小,则Rf值小;反之,Rf值大.②吸附剂的性 质和质量:不同批号和厂家的产品,其性质和质量不尽相同.③吸附 剂的活度.④薄层的厚度.⑤层析槽的形状,大小和饱各度.⑥展层 方式.⑦杂质的存在和量的多少.⑧展层的距离.⑨样品量.⑩温度. 由于影响Rf值因的因素很多,故不能仅根据Rf值来鉴定未知样品组 分.一般采用几种薄层层析法来确证样品的未知组分,如一种用吸附 薄层层析,另一咱用聚酰胺薄层层析等.实践中,也可把未知样品与 标准品混合点样,然后进行薄层层析.如果在几个不同类型的薄层层 析中,两者都不发生分离,则可证明这两个化全物是相同的. 【注意事项】
1.制备薄板时,薄板的厚度及均一性对样品的分离效果和Rf值的 重复性影响很大,普通薄层厚度以250 m为宜.若用薄层层析法制 备少量的纯物质时,薄厚度可稍大些,常见为500～700 m,甚**1～2㎜.
2.活化后的薄层析在空气中不能放置太久,否则会因吸潮降低活 性.
3.用于薄层层析的样品溶液的质量要求非常高,样品中必须不含 盐,若含有盐分则会引起不严重的拖尾现象,甚**有时得不到正确的 分离效果.
4.样品溶液应具有一定的浓度,一般为1～5g/L,若样品太稀, 点样次数太多,就会影响分离效果,所以必须进行浓缩处理. 5.样品的溶剂**好使用挥发性的有机溶液(如乙醇,氯仿等), 不宜用水溶液,因为水分子与吸附剂的相互作用力较弱,当它点据了 吸附表面上的活性位置时,就使吸附剂的活性降低,从而使斑点扩散. 6.样品点样量不宜太多,若点样量超载(即超过该吸附剂负载能 力),则会降低Rf值,层析斑点的形状被破坏.点样量一般为几到几 十 g,体积为1～20 L.
7.展层必须在装闭的器皿中进行,器皿事先应用展层溶液剂饱 和,把薄板的点样端浸入展层剂中,深度约为0.5～1.0cm.千万勿 使点样斑点浸入展层溶剂中. 8.展层溶剂的选择:
(1)根据溶剂的结构,性质的不同而定,主要以溶液剂的极性 大小为依据.在同一吸附剂上,溶剂极性越大,对同一性质的化合物 的洗脱能力也越大,即在薄层板上把这一化合物推进得越远,Rf值也 越大.如果发现用一种溶液支展开某一化合物,其Rf值太小,则可考 虑换用另一种极性较大的溶剂,或在原来的溶剂中加入一定量极性较 大的溶液进行展层.溶液极性极大小次序如下:水>甲醇>正丙醇>丙 酮>乙酸甲酯>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>三氯甲烷>苯>三氯乙烯>四氯化 碳>二硫化碳>石油醚.
(2)根据被分离物质的极性和吸附剂的性质而定.在同一吸附 剂上,不同化合物的吸附规律是:①饱和碳氢化合物不易吸附或吸附 不牢.②不饱和碳氢化合物被吸附,含双键越多,吸附得越牢.③碳 氢化合物被一个功能基取代后,其吸附性增大.各功能基使吸附性增 大的递增顺序是:
在薄层上,对于吸附较大合物,一般需用极性较大的溶剂(展层 剂)才能推动它.表2列出一些物质的展层溶液系统. (3)若样品组分具有酸碱性,则可将展层的pH值作适当调整. 若样品组分为碱性,则调节展层溶剂 pH为碱性,以增加展层溶液的 分辨率,使样品在薄板上展层后,斑点圆而集中,避免拖尾现象.当 样品组分具有酸性时,调节展层溶剂pH为酸性,可得到圆而集中的斑点.
9.在薄层层析时,层析缸溶剂饱和度对分离效果影响较大,在不 饱和层和析缸中,展层易引起边缘较应,因为极性较弱的溶液和沸点 较低的溶剂在边缘挥发得快,从而使样品组分在边缘的Rf值高于中部 的Rf值,用饱和的层析缸可以消除边缘效应.
10.为了获得更好的薄层层析的效果,也可采用双向展层,多次 展层和连续展层.多次展层是指选用一种溶剂展开**一定距离后,将 薄层板取出,待溶剂挥发后再按同一方向用第二种溶液展开. 11.薄层层析展开后,对被分离的样品组分进行定性或定量分析, 都要用不同的显色方法先确定它们的位置.有的物质在紫外灯下可显 示出荧光斑点,如核苷酸等;对于在紫处光下不显荧光的样品,可用 荧光薄层检出,该薄层的制法是将荧光物质(1.5%硅酸镉粉)加入吸 附剂中,或在薄板上喷0.04%荧光钠水溶液,0.5%硫酸奎宁醇溶液及 1%磺基水杨酸的丙酮溶液;有的有色物质在展层后可显示有颜色的斑 点;对无色化合物的显色,主要采用两种方法,即物理方法和化学方 法.物理方法如用紫外灯照射,属非破坏性显色方法.化学方法如用 茚三酮显色剂喷雾显色可使氨基酸类化合物显色;对于无机吸附剂制 成的薄层,可用强腐蚀性显色剂如硫酸,硝酸或其他混合溶液,因为 这些显色剂几乎可使所有机化合物转变成碳,为破坏性显色方法,此 类显色剂称为**显色剂,但它们不适用于定量测定或制备用的薄层 上. #p#分页标题#e#
【材料与试剂】
1.实验材料:木糖(或棉子糖),葡萄糖,蔗糖,混合样品,硅 胶G 2.实验试剂
(1)1%糖标准溶液:取木糖(或棉子糖),葡萄糖,蔗糖各1g, 分别用75%乙醇溶解并定容到100mL .
(2)1%糖标准混合溶剂:取上述各种糖各1g,混合后用75%乙 醇溶解并定容**100mL. (3)0.1mol/L硼酸(H3BO3)溶液. (4)展层溶剂:氯仿:甲醇=60:40(V/V).
(5)苯胺-二苯胺-磷酸显色剂:1g二苯胺溶于由1mL苯胺,5mL 85%磷酸,50mL丙酮组成的混合溶液中. 【实验器材】
①烧杯;②玻璃板(8cm 12cm);③层析缸( 15cm 30cm); ④毛细管( 0.5mm);⑤玻棒;⑥喷雾器;⑦烘箱;⑧尺,铅笔;⑨ 干燥器.
TLC中展开剂的选择
做分离时跑板子是常有的事，展开剂的选择就**关重要了。
选择适当的展开剂是shou要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇.使用单一溶剂往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就shou先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂**好用新鲜配制。 一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到**佳效果。我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，**后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶剂。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到**佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），**好是换溶剂。对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同 。 谈薄层色谱展开剂选择 (转)
根据本人的几年薄层层析经验，参考药典等*家药品标准和有关文献，将 2000版药典一部里部分有代表性的对照品的薄层层实例按展开剂极性排序，并对其规律做一些分析。以下的分析和介绍是总体描述性的，目的是快速、简便地选择展开剂。如果想了解展开剂选择的各种理论，请参考其他专著。
选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。 列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。环已烷 :-0.2、石油醚（Ⅰ类，30~60℃）、石油醚（Ⅱ类，60~90℃）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2 [1] 。
关于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第三种溶剂来调和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。
一般正相色谱，固定相为极性，被分析物质的极性越大，需要极性更大的展开剂。 了解被分析物的极性可以通过分析其结构获得，很难获得它的极性指数。物质分子化学结构中，通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。 ， 依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。
相应展开剂分别为：正己烷—乙醚—冰醋酸 (5:5:0.1)、苯－冰醋酸－甲醇(30:1:3)、氯仿－甲醇－甲酸（9:1: 0.5）、石油醚－乙酸乙酯－甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯－甲酸－水(7:2.5:2.5)。（由于薄层板、比移值不同的原因，展开剂极性比较是相对的，并非**的后者大于前者）。 现在**重要的问题是，不同化合物，怎么定它的极性，又用什么标准来定它对应的展开剂呢？以下分开讨论不同化合物极性情况及其对应的展开剂。 #p#分页标题#e#
shou先是极性较小的挥发性物质。比如：冰片：石油醚 (30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、厚朴酚：苯－醋酸乙酯(9:1.5)、α-香附酮：苯－醋酯乙酯－冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：环己烷－醋酸乙酯(3:1)，这类化合物，以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂，通常起溶解和分离化合物的作用，而用醋酸乙酯为调节Rf（比移值）的溶剂。为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响，适当加入添加剂，如有机酸或者有机碱。
极性较小的不挥发性物质。比如：β -谷甾醇：环己烷－醋酸乙酯－甲醇(6:2.5:1)或者环己烷－丙酮(5:2) 、熊果酸：甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(12:4:0.5)、齐墩果酸：氯仿－甲醇(40:1)、猪去氧胆酸：氯仿－乙醚－冰醋酸(2:2:1)、大黄素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇 (8:1)、丹参酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4) 、穿心莲内酯：氯仿-无水乙醇(9:1)、靛玉红、靛蓝氯仿－乙醇(9:1)或者苯－氯仿－丙酮(5:4:1)。这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些，因为这类物质极性小的母核大，而极性大的基团通常可以形成氢键，比如羧酸、羟基。以上物质，母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加（尤其是出现苯环），极性基团的增加，都使极性增加，展开剂极性也增大。这个范围内的物质很多，一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的顺序，按照极性要求选择。这里注意，异丙醇、正丁醇极性指数也比较小，在这范围的化合物很少用，因为粘性大、展开慢，造成斑点扩散；另外，羟基的氢键作用力也有不利。调节Rf值的溶剂，从醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。挥发性物质也有很多带羰基、羟基的，但从它的挥发性就可以明白，分子间作用力不强，另外，母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小，估计更容易脱离硅胶吸附，更快进入溶剂中，而不需要通过提高展开剂的极性。 皂苷类。人参皂苷：氯仿－甲醇－水 (65:35:10)10℃以下放置的下层溶液或正丁醇－醋酸乙酯－水(4:1:5)的上层溶液或氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液、芍药苷：氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸(40:5:10:0.2)、黄芩苷：醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯—醋酸乙酯—甲酸—水(1:12:2.5:3)的上层溶液、葛根素：氯仿－甲醇－水(14:5:0.5)、芦丁：醋酸乙酯－甲酸－水(8:1:1)。这类物质，由于存在糖的多羟基结构，苷元的结构影响变小。展开剂中使用极性大的有机溶剂（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展开剂极性，另外也可以抑制硅胶羟基的作用，减少拖尾。由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。 极性大的小分子有机酸。没食子酸：氯仿－醋酸乙酯－甲酸 (5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。这类物质多数是苯乙烯母核的，这个结构的极性本身比较大，另外有酚羟基和羧酸基团，个别有多羟基配基。皂苷的展开剂差不多，极性大。注意甲酸通常指的是浓度85%左右的，含有水。
含氮有机物。盐酸小檗碱：苯－醋酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸气饱和) 或正丁醇－冰醋酸-水(7:1:2)、麻黄碱：氯仿－甲醇－浓氨试液(20:5:0.5)或正丁醇－冰醋酸－水(8:2:1)、甘草酸铵：醋酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水(15:1:1:2)。由于NH2硅醇基的作用很强，在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。对于极性化合物，使用正丁醇对斑点扩散影响较小，因为化合物和硅胶的作用强。
进行薄层分析基本可以根据母核、基团，选择相似的化合物对号入座。当然，具体的条件优化则需要根据实际情况了。遇到较困难的分离，需要使用到设计优化方法的，已经不属于本文讨论范围了。
什么是薄层层析？原理是什么？
薄层层析又叫薄层色谱，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚**0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。
一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚**0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10×3cm左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。#p#分页标题#e#
薄层层析法具体操作注意事项
铺板
铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响**大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。
点样
尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，**好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。
展开剂配制
选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。**不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的**高精确度，比如：取
1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。
展开系统的饱和
一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。
温湿度的控制
温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。
显色
喷显色剂显色**重要是有好的雾化器
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相 的吸附柱。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率**高的，但是时间也**长，比如天然化合物的分 离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚**更多，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得 不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过 减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念 头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力 的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解 的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得 加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的**好。
柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是 样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二 厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只 有0.5厘米，那么各榉志捅冉先菀椎玫酵耆掷肓恕５比徊捎么执蟮闹右冉隙?的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选 择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质 相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子 ）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也 可以减小淋洗剂的极性等等。
关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。
可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前**少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅 胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也 是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。**于是 加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显 色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十 个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。 #p#分页标题#e#
无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外， 很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中 性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。 听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一 照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。
※ 关于湿法、干法上样。
湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好 ，不然溶剂就成了淋洗剂了。 很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一 般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较 好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶 那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。 有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走， 显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1： 1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样 品没有吸附在硅胶上）。
溶剂的选择。当然是**便宜，**安全，**环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用 正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因 为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别 让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸 附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些 。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后 继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。 由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑 料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色 的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过 原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。
另外溶剂在过柱子后**好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点 是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和 乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导**性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋 洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂**后回收要采用常压，因为 在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和 你下面要过的样品有反应那就惨了。
关于操作问题。 1 装柱。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。 干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧 密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写 的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就 全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是 开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚**作废！
2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降**石英砂面时，再 加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了） ，再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
3 淋洗剂的选择。
感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过 柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一 个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3 ）的三次方或四次方大。
4 样品的收集。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比 较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以 采用氧化铝作固定相。
另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就 收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。
5 **后的处理
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送 分析，**好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没 了，必要时进行重结晶。 另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是 和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在 #p#分页标题#e#
室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候， 可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用 的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而 乙醚却要选择30－60的石油醚。二是：不论是用带砂板的还是塞棉花的， 在装柱之前，都要将空气用加压方法将空气排干，这样就可避免柱中有 空气！过柱子需要耐心，不要着急.
