一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度shou先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的**大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
Kav是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的Kav=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而**先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的Kav=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而**后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤Kav﹤1，在中间位置被洗脱。可见，Kav的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。
本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因Kav值不同而被分离。 三、仪器与试剂
1.器材：层析柱、
恒流泵、自动
部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂
（1）标准蛋白
a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液 （3）蓝色葡聚糖－2000、葡聚糖凝胶Sephadex G-75。 四、实验内容
（一）凝胶的前处理（已做好）
将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱液于室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌，以防凝胶交联结构的破坏。 （二）装柱（已做好）
取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1～2cm 高度后打开出水口，使凝胶沉降，并不断加入凝胶浓浆。注意装柱过程中注意凝胶不能分层。 （三）平衡
装柱完成后，接上
恒流泵，以0.9%的氯化钠为流动相，以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度开始洗脱，用1～2倍床体积的洗脱液平衡，使柱床稳定。（实验中平衡1hr）
（四）凝胶柱总体积（Vt）的测定。
平衡完毕后，测定凝胶柱床的高度，计算柱床总体积Vt（凝胶柱直径为1 cm或1.6cm）。 （五）V0的测定 打开出水口，使残余液体降** 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取0.2ml（4mg/ml）蓝色葡聚糖-2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液冲洗2次，待渗入胶床后，再在柱上端加满洗脱液，开始洗脱，作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始**洗脱液中蓝色葡聚糖浓度**高点（肉眼观察）的洗脱液体积即为V0。
蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液继续平衡１～２倍床体积（实验中平衡1hr），以备下步实验使用。 （六）上样、洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。用移液管吸取0.5mL蛋白质混合液小心地加到凝胶床上，打开出水口，待样品完全进入凝胶后，加少量洗脱液冲洗柱内壁2次，待液体完全流进床内后，关闭出水口。在柱上端加满洗脱液，打开
恒流泵，开始洗脱收集，6min一管。用紫外分光光度计测定各管收集液的OD280值，以洗脱体积为横坐标，OD值为纵坐标绘出洗脱曲线。 （七）凝胶柱的处理（不做） #p#分页标题#e#
一般凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2～3倍床体积）通过柱即可。如若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如果不用，需要加0.02%的叠氮化钠防腐。 五、结果与讨论 1. 绘制洗脱曲线。
以洗脱体积为横坐标、OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出洗脱曲线。并标出各成分的Ve值。 2. 计算各成分的Kav值。
