实验目的
1、掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。 2、熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。
实验原理
荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。
DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。
DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。
聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。
实验器材及试剂
器材：聚酰胺薄膜（7cm×7cm）、小钟罩、吹风机、小离心管、毛细管、紫外分析仪、小培养皿、移液枪
试剂：pH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸；展层液（以甲酸：水==1.5:100配制）
操作方法
1、DNS-Cl标记PH9.9的标准氨基酸
取4个小离心管，分别加入三种标准氨基酸以及混合氨基酸各30微升，在各加入30微升DNS-Cl丙酮溶液，充分混合。然后将4个离心管在37度水浴中保温1h。 2、点样
在距边0.5cm处画一基线，在上面每隔1.5 cm画—点作为点样位置。用毛细管取样，点在聚酰胺薄膜点样位置上，点样直径不得超过2mm，若需要多次点样时，应当将**次样品点吹干后，再点第二次。 3、展层
将点完样的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，箍以线圈或胶片圈(将旧的35 mm照相底片在1 mol／L氢氧化钠溶液中煮沸4小时，然后用水冲洗干净，做成小箍即可用)。展层容器用小干燥器或小钟罩，内放一小培养皿，倒入5-10 mL展层溶剂进行展层，以溶剂前沿走到距边约0.5cm为度(约10～20分钟)，取出薄片，然后用吹风机吹干。 4、透射
将聚酰胺薄膜**于紫外分析仪中，观察荧光斑点。
实验结果
实验结果图谱（铅笔勾线）（从左到右依次为丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、混合样品）
注意事项
1、水浴时检查水浴锅是否漏水，若漏水应及时处理。2、向离心管中加入氨基酸时要做好标记，以免弄混。
3、实验中要保护好聚酰胺薄膜，拿的时候要拿光滑面，粗糙一面不得沾水污染，也不得有划痕，否则会影响实验结果。
4、点样时注意毛细管的内径，若是1mm则点样一次，若是0.7或0.8mm则点样2到3次。
5、每次点完样要用电吹风的冷风吹干。 6、点样的直径**好不要超过2mm。
7、展层时注意展层液液面不能高过点样处，否则样品会溶于展层液。薄膜在展层液中应保持直立，不可卷曲成漏斗状，否则会使样品路径不平行，影响准确性。 8、圈画斑点时要戴手套，隔着玻璃观察，防止紫外线伤害。
分析讨论
1、水浴时要确保离心管与架子卡死，否则会使离心管漂在水面上，影响水浴效果。离心管的盖子也要盖好。
2、点样时毛细管碰一下薄膜即可，若接触时间过长会使点样的直径过大。点样间的间距控制在1到1.5cm，太近可能会有样品重叠。点样应处于一条线上，该线距离膜端0.5cm左右。点样前可用铅笔画一条直线，画线时力度不可过重，否则影响实验。点样的力度也要控制好，不可用力过猛。
3、展层时薄膜用橡皮筋束缚成半圆状立于装有展层液的平皿中。建议使用两个橡皮筋捆绑，否则容易使薄膜卷曲变形。用棉线绑薄膜更好，因为橡皮筋可能会带有某些有机物，产生多余的斑点。 #p#分页标题#e#
4、当DNS-Cl过多时会产生DNS-NH2，后者在紫外照射下显示蓝色荧光。所以薄膜中间会有四个蓝色荧光。而赖氨酸与DNS-Cl反应生成DNS-ε-赖氨酸的同时也生成了DNS-双-赖氨酸，所以赖氨酸的条带有两个黄绿色荧光斑点，一个为点状，另一个呈月牙形。
5、样品中有两个斑点，分别与丙氨酸、苯丙氨酸等高，说明样品中含有丙氨酸和苯丙氨酸两种氨基酸，而不含有赖氨酸。
6、在圈画斑点时要戴手套，用铅笔轻轻画线，否则很容易刺破薄膜。
